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La tomographie dynamique d’émission par positrons : un outil pour évaluer l’efficacité de la thérapie photodynamique du cancer

The RNA cap synthesis as a potential target for the development of novel antifungal and antiviral therapies

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Mots clés

Summary

Dynamic positron emission tomography (PET) using 2-deoxy-2-[18F]fluoro-D-glucose (FDG) has been used to study action mechanisms and efficacy of photodynamic therapy (PDT) of cancer in real time. Tumor bearing mice are placed in a dedicated animal PET camera 24 h after photosensitizer administration and FDG is infused over a 3-hour period while PET data are acquired in list mode. Thirty minutes after starting the FDG infusion, tumors are exposed to red light using continuous or fractionated illumination protocols. The PET data are reconstructed to obtain a series of images with predetermined time intervals. The FDG activity over the treated and reference tumors are plotted as a function of time and FDG uptake rates before, during and after light treatment are calculated. Most treatment protocols lower the tumor FDG uptake rate during light treatment followed by a recovery phase after PDT. Optimal tumor response is characterized by rapid and large changes in the FDG uptake rates reflecting the involvement of both vascular and direct tumor cell kill effects.

Résumé

L’imagerie dynamique par tomographie d’émission par positrons (TEP) combinée avec une infusion de 2-désoxy-2-[18F]fluoro-D-glucose (FDG) est utilisée pour étudier les mécanismes d'action et l’efficacité de la thérapie photodynamique (TPD) du cancer en temps réel. Des souris cancéreuses sont injectées dans la veine caudale avec différents photosensibilisateurs (PS), puis sont placées 24 h plus tard dans un scanner TEP animal et infusées avec du FDG pendant 3 h tout en acquérant des images TEP en mode liste. Trente minutes après le début de l’infusion, l’une des tumeurs est illuminée, soit en continu soit en alternance, avec de la lumière rouge. Les données TEP sont ensuite reconstruites pour obtenir une séquence d’images à des intervalles prédéfinis. Les taux de captation du FDG dans les tumeurs traitées et de référence avant, pendant et après l’illumination sont obtenus à partir des courbes d’activité en fonction du temps. La plupart des protocoles d’illumination testés induisent une réduction du taux de captation du FDG dans la tumeur traitée durant la TPD, suivie par une remontée après TPD. Une régression tumorale optimale est associée à un profil FDG-TEP caractérisé par une réponse rapide et sévère, provoqué par l’action combinée de la mortalité cellulaire directement au niveau des cellules tumorales et indirectement par la voie vasculaire.

Article

La tomographie d’émission par positons (TEP) est une méthode d'imagerie médicale qui permet de visualiser et de mesurer des processus biochimiques in vivo, comme l'activité métabolique glycolytique, en détectant la présence de molécules radioactives dans les tissus. La TEP-FDG se fond sur la mesure de l’accumulation du 2-désoxy-2-[18F]fluoro-D-glucose (FDG) dans les cellules. Cet analogue du glucose est en effet internalisé et métabolisé comme le glucose. Après transformation en fluorodésoxyglucose-6-phosphate par l'hexokinase, la présence du fluor bloque sa dégradation subséquente et il se retrouve piégé dans la cellule tumorale. Le FDG est de loin le traceur le plus utilisé comme marqueur du taux d’activité métabolique des cellules tumorales ou comme indice de survie des cellules après traitement cytotoxique [1] Chaque fois qu’il y a une désintégration de l’atome de 18F marquant le FDG, il y a émission d’un positron (β+) et d’un neutrino qui se partagent l’énergie d’émission. Le positron émis du noyau de 18F parcourt quelques millimètres dans le tissu, en dispersant son énergie cinétique pour s’annihiler finalement avec un électron du milieu environnant. L’annihilation de ces deux particules émet deux photons opposés de 511 keV. La détection de la trajectoire de ces photons par la caméra TEP permet de localiser le lieu de leur émission et donc la concentration du traceur en chaque point de l'organe. L’imagerie TEP est un outil qui permet ainsi de dépister certaines pathologies caractérisées par une altération de la physiologie normale, tel les cancers. La thérapie photodynamique (TPD) vise la destruction des tumeurs grâce à l'action concertée de trois facteurs inoffensifs : la lumière visible, le photosensibilisateur (PS) et l’oxygène (O2) [2] Une première étape permet une accumulation du PS dans la tumeur. Une seconde étape vise l'excitation du PS pour que celui-ci réagisse avec les molécules biologiques environnantes ou l’O2 moléculaire, générant des espèces hautement réactives (oxygène singulet, anion superoxide, radicaux hydroxyles, etc.) [3] Ces espèces réactives induisent des dommages cytotoxiques menant à la régression de la tumeur par destruction des cellules (le mécanisme direct) ou par la destruction de la vascularisation (le mécanisme indirect) [4] De plus, les dommages photo-toxiques induits peuvent activer une réponse immunitaire provoquant la libération d’agents inflammatoires [5, 6] La régression tumorale semble dépendre du degré de contribution de chacun des mécanismes décrits (figure 1) [7].

La première voie détruit directement les cellules tumorales entraînant une destruction du tissu visé, en particulier au niveau des mitochondries, des lysosomes et de la paroi cellulaire. La deuxième voie, commune pour la plupart des PS, procède par la détérioration des cellules endothéliales du système vasculaire de la tumeur induisant une cascade de réactions biochimiques, possiblement liée à l'activation de plaquettes et le dégagement de la thromboxane. Ces événements vasculaires mènent à l'occlusion vasculaire et la mort ischémique des cellules restantes de la tumeur. Une régression tumorale complète nécessite une contribution des deux voies. L'implication d'une voie secondaire dominée par l'activation d'une réponse immunitaire non spécifique locale ou disséminée dépend de la sévérité des dommages induits par la photosensibilisation. Cette réponse primaire peut déclencher une mort secondaire dominée par la réponse immunitaire de l'hôte. Les dommages primaires induisent plusieurs formes de stress oxydatif qui provoquent à leur tour une réponse adaptative complexe. Cette réponse secondaire provoque l'activation de plusieurs signaux cellulaires responsables de la régulation des protéines du stress et de la transcription d'une multitude de gènes de l'inflammation. Par la suite, une libération de nombreux médiateurs inflammatoires stimule les mécanismes de défense. La phase systémique fait appel à ces médiateurs qui sont synthétisés localement ou qui sont à l'état de précurseur inactif dans la circulation.

L’efficacité de la TPD dépend des caractéristiques du PS et du protocole d'illumination. Le fractionnement ou une diminution du débit (taux de fluence) de la source lumineuse peut augmenter la réponse tumorale, bien que des effets contraires puissent également se produire. À cet égard, l'optimisation des protocoles d’illumination vise à préserver l’oxygénation de la tumeur tout en maximisant la destruction du PS pendant le cycle d'éclairage [9, 10]. En raison de la courte demi-vie des espèces réactives de l’oxygène générées lors de la photothérapie, la localisation subcellulaire du PS au moment de l’illumination va déterminer l'efficacité et le mécanisme de mort cellulaire [11]. Le degré et la contribution relative des mécanismes directs et indirects de l’inactivation cellulaire dépendent en partie de la distribution du PS entre les composantes vasculaires et cellulaires mais aussi d’autres paramètres tels que les doses de lumière et de PS, le délai entre l’injection du PS et le début de l’illumination, la lignée de cellules tumorales, le niveau d’oxygénation, etc. [12]. De plus, in vivo, nous devons tenir compte de la réaction de l'hôte et de la présence d'une entité hétérogène proliférant à partir des tissus de son hôte. La tumeur est composée de cellules tumorales et du stroma. Ce dernier est composé d’un tissu conjonctif de support et d’un système vasculaire nourricier pouvant aussi contribuer à l'accumulation du PS.

À cet égard, les PS plus hydrophobes (amphiphiles), tels le zinc disulfophtalocyanine (ZnPcS2: R1=H, R2=SO3Na; figure 1B), qui sont préférentiellement transportés par des lipoprotéines, sont captés relativement rapidement par les cellules endothéliales et tumorales, alors que les PS hydrophiles, comme le tétrasulfophtalocyanine (ZnPcS4 : R1=R2=SO3Na; figure 1B), qui se lient plus fortement à l’albumine, se concentrent principalement dans le stroma de la tumeur [13]. Par conséquent, ZnPcS2-TPD agirait directement sur les cellules tumorales, ce qui provoque la destruction rapide et importante au sein de la zone éclairée. Son effet sur la vascularisation (effet indirect) serait limité à augmenter la perméabilité vasculaire. En revanche, ZnPcS4-TPD induit principalement une réponse vasculaire qui comprend un rétrécissement transitoire des artérioles [14].
Un protocole d’imagerie dynamique TEP-TPD, combiné avec une infusion constante de FDG, permet le suivi en temps réel des changements métaboliques systémiques transitoires résultant de la photothérapie [15]. Les variations dans les paramètres métaboliques peuvent être utilisées pour distinguer les mécanismes d’action des différents PS. Comme on pouvait s’y attendre, l’application de la TPD induit une baisse de la captation du FDG, ce qui reflète le degré d’inactivation cellulaire ou vasculaire au cours de la photothérapie. Une augmentation inattendue du taux de captation du FDG après l’illumination, reflète une demande accrue d’énergie due soit à l’activation des mécanismes de réparation des cellules soit des processus de mort cellulaire, aussi bien qu’à l’invasion des cellules inflammatoires au site illuminé [16]. Les différences dans les taux de fixation du FDG peuvent être utilisées pour quantifier la réponse tumorale ou identifier le mécanisme d’action menant à une régression tumorale.

Dans cette étude, nous évaluons l’influence des PS ou du protocole d’illumination sur le rendement de la TPD. Le di- et le tétrasulfophtalocyanine (ZnPcS2 et ZnPcS4) ont été sélectionnés en raison de leurs différents mécanismes d’action même si leur coefficient d’extinction molaire à 680 nm (2,5 × 105 M-1cm-1) et leur rendement quantique en oxygène singulet (~0,5) sont comparables [17, 18]. Deux tumeurs EMT-6 ont été implantées sur le dos de souris Balb/C femelles. Quand la tumeur atteint un diamètre de 5-8 mm, les animaux sont injectés avec un PS (1 µmole/kg, i.v.) et 24 heures plus tard ils sont anesthésiés à l’isoflurane et placés sur le lit chauffant du scanner TEP avant de débuter l’infusion de FDG (0,003 ml/min) et l’acquisition dynamique d’images d’une durée totale de 3 heures. Après 30 min, une tumeur est exposée à la lumière rouge (680 nm) en utilisant soit un protocole d’illumination continue (33 min) soit fractionnée (5 min “on”, 2 min “off”, et ce, sur 40 min). Le choix de ce dernier protocole est basé sur la dose totale de lumière, un temps d’illumination ne dépassant pas 45 minutes et un délai minimal requis pour permettre une réoxygénation de la zone traitée [19]. Les images sont ensuite reconstruites selon une séquence de 45 tranches de 120 sec et 18 de 300 sec, puis analysées par régions d'intérêt (ROI) avec le logiciel LabTEP Sherbrooke. Les courbes d’activité en fonction du temps (CAT), corrigées pour la décroissance radioactive, sont ensuite tracées et l’estimation des paramètres de captation du FDG est effectuée selon le modèle illustré à la figure 2B. Les changements dans le taux d’accumulation du FDG dans les tumeurs traitées avant, pendant et après l’illumination sont visibles sur les images TEP dynamiques obtenues sur une période de 3 heures (figure 2A) et les CAT correspondantes (figure 2C, gauche), ainsi que les changements des taux de captation du FDG (Tableau 1). Les courbes différentielles (figure 2C, droite) soulignent la différence de taux de captation du FDG en fonction du protocole d’illumination entre les tumeurs traitées et leurs tumeurs de référence.

Les variations des taux de captation du FDG avant (m1), pendant (m2) et après la phase d'illumination (m3), avec le délai de réponse (Δ1) et le délai de récupération (Δ2) sont liées au mécanisme d’action de la TPD (figure 2C). Une forte baisse du taux de captation du FDG durant la photothérapie associée à une diminution importante accompagnée d’une reprise rapide du taux de captation du FDG indiquerait une mort cellulaire directe, tandis qu’une réponse modérée combinée à un long délai de récupération suggère un dommage vasculaire, conduisant à une mort cellulaire par une voie indirecte (Figure 1). L’augmentation du taux de captation du FDG observée après l’illumination pourrait dépendre de la demande énergétique requise pour l’activation des différents processus de réparation ou de mortalité cellulaire. Par ailleurs, l’inflammation fait partie du processus de guérison : l’activité métabolique associée à l’invasion des cellules inflammatoires et les besoins énergétiques des cellules tumorales survivantes pourraient expliquer en partie le phénomène observé dans les tumeurs après TPD.

La plus forte baisse du taux de captation du FDG (~ 40%) a été observée avec ZnPcS2 et illumination continue, qui combinée au délai relativement court du temps de réponse, est conforme avec un mécanisme d’action principalement par voie directe (Tableau 1). Une faible diminution du taux de captation tumorale du FDG (5%) et l’augmentation des délais de réponse observés avec ZnPcS4 sont également compatibles avec un effet indirect. Le fractionnement de la lumière n’a pas permis d’accroître significativement l’efficacité de la TPD dans ce cas. Le traitement induit seulement une modification mineure des taux de captation du FDG pour ZnPcS2. Cependant par rapport au protocole d’illumination continue, nous remarquons une nette augmentation du temps requis pour observer un signe de récupération, ce qui indique une contribution accrue du mécanisme indirect de mort cellulaire. Dans le cas de ZnPcS4-TPD, aucune variation du taux de FDG dans des tumeurs n’est observée mais on note une réduction importante des valeurs de Δ1 et Δ2. L’illumination fractionnée réduirait donc les dommages photochimiques au niveau cellulaire et vasculaire. Des études complémentaires pour élucider le rôle des différents mécanismes d’action de la régression des tumeurs en utilisant des inhibiteurs sélectifs et/ou des radiotraceurs alternatifs sont présentement en cours. Une optimisation du cycle de fractionnement de la dose de lumière permettrait de valider le choix du protocole d’illumination et de vérifier la pertinence d’utiliser un autre protocole de fractionnement.

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Légendes des figures

Figure 1

A) Schéma représentant la régression tumorale in vivo [7]

B) la structure des phtalocyanines utilisés récemment dans ce type d’étude [8]: ZnPcS2: R1 = H, R2 = SO3Na; ZnPcS4 : R1 = R2 = SO3Na.

Le panneau A illustre les trois principales voies activées par les dommages provoqués par les espèces réactives produites à la suite de l’interaction entre le photosensibilisateur (PS), la lumière (hυ) et l’oxygène moléculaire (O2).
L’effet direct cause des dommages au niveau cellulaire, tandis que l’effet indirect procède par la détérioration du système vasculaire et le relâchement des agents inflammatoires et vasoactifs. Les conséquences de la destruction du microenvironnement sont sévères pour la tumeur. Une réduction du flot sanguin oxygéné et une induction de l’hypoxie sont détectables dès les premières minutes de l’illumination tout en provoquant un appauvrissement de la tumeur en nutriments et en oxygène conduisant à la mort ischémique des cellules tumorales. Suite aux dommages cellulaires et vasculaires, il y a activation de la réponse immunitaire de l’hôte. Ces réactions impliquent en premier lieu la phagocytose des cellules endommagées par les macrophages. Vient ensuite l’activation des lymphocytes T grâce à l’inflammation produite après traitement via les cellules présentatrices d’antigènes. Même si la TPD est un traitement ciblant une région précise, les effets systémiques inflammatoires et immunitaires ne sont pas limités à la région illuminée. L’effet photodynamique global ou la régression tumorale découlent de la sommation des effets individuels des trois mécanismes impliqués.

Figure 2

A) Évolution de l’incorporation du FDG dans les tumeurs de référence et traitées par illumination continue ou fractionnée [8].

B) Représentation schématique du modèle d’analyse des courbes d’activité relative du FDG dans les tumeurs traitées (○) et de référence (□) décrivant cinq paramètres : taux de captation avant, durant et après TPD (m1, m2, m3), et les délais de réponse (Δ1 et Δ2). C) Courbes d’activité vs temps (gauche) et courbes différentielles correspondantes (droite) déduites des images obtenues de la dynamique TEP d’une durée d’enregistrement de 3 h. Tumeurs de référence non exposées à la lumière (▲); tumeur traitée avec illumination continue (●) et illumination fractionnée (■).

Figures et tableaux

  • Figure%201%20msa2011-12
  • Figure%202%20msa2011-12
  • Tableau%201%20msa2011-12

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